Диагностические оценки и рекомендации по основным методам выявления SARS-CoV-2 

А) ГЕНОДИАГНОСТИКА SARS-COV-2– признан главным лабораторным инструментом в противодействии эпидемии COVID-19. 

Основные проблемы молекулярной диагностики SARS-CoV-2: 
Пробоподготовка – причина ложноотрицательных результатов. Даже при соблюдении всех правил забора биоматериала, наиболее низкая концентрация вируса выявляется в верхних дыхательных путях, а наиболее высокая в нижних отделах. Опубликованные работы убедительно показывают недостаточную чувствительность мазков носо- и ротоглотки, особенно в первые 8 дней от контакта с вирусом, что является причиной ложноотрицательных результатов (до 20%). Именно поэтому во многих развитых странах ПЦР-диагностику от каждого пациента проводят четырехкратно. И в этой связи, правильный забор и хранение мазка является архиважным. Однако, в нашей стране, в силу недостаточного снабжения и/или понимания проблем низкой концентрации вируса, забор мазка проводят ушными палочками (длина которых просто не способна достичь локации вируса и они на хлопковой основе), с последующим помещением образца в физ. раствор и длительным(до 5 дней) его хранением до этапа выделения в ПЦР-лаборатории.  Для такого хранения необходимо использовать транспортные среды, способные блокировать разрушение РНК, так как РНК-содержащие вирусы являются крайне нестабильными. 
Около 70% - значимость этапа прободоподготовки в достоверной ПЦР-диагностике. 
Рекомендация: использовать только специальные зонды (не деревянная палочка и не хлопковый тампон) и транспортные среды для забора и длительного хранения; проводить постоянный тренинг и мониторинг специалистов осуществляющих забор мазков, выдавать на руки памятки. 

Длительность и чувствительность тестирования. Во время разгара распространения инфекции важна скорость выдачи результата анализа. Это зависит не только от количества задействованных ПЦР-лабораторий в стране, но и вида используемых ПЦР тест-систем. В отличии от начала объявленной пандемии (декабрь, январь), когда на каждого пациента ставили 3 отдельные пробирки, что значит в три раза меньше объемов диагностируемых анализов в амплификаторе, сегодня, большинство производителей используют мультиплекс технологию, то есть все генырекомендованные ВОЗ - RdRp, E,N и Sв различных сочетаниях, и в одной пробирке. Но даже при этой усовершенствованной технологии скорость выдачи результата все еще считается недостаточно быстрой и занимает в среднем 4-5 часов чистого времени на постановки. Некоторые западные исследователи начали дополнительно, для массового скрининга применять быстрые и экономичные тесты к одному гену E, который показал себя более чувствительным, чем к RdRP. Или вместо двухшаговой ОТ-ПЦР, с промежуточным этапом создания копий ДНК по исходному РНК вируса, используют одностадийную методику в одной пробирке, в которой используется одна реакционная пробирка, что сводит к минимуму риск загрязнения (ложноположительные результаты). В нашей стране рекомендуют использовать отечественные наборы разработанные к трем участкам генома вируса, с использованием 3 пробирок на каждого пациента, во всеми вытекающими. 
Кроме того, применяемые в РУз тест-системы имеют чувствительность от 1000 к/мл, что создает дополнительную основу для ложноотрицательных результатов. 
Рекомендация: для быстрого скрининга больших объемов ввести тест-системы либо формата мультиплекс, либо по 1 гену и с чувствительностью хотя бы 100-500 к/мл. Это позволит в несколько (до 7) раз быстрее и дешевле (до 2раз) проводить массовое тестирование.

Б) СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ
В настоящее время на рынке существует огромное количество серологических тестов. В идеале следует использовать только высококачественные анализы с чувствительностью более 95% и специфичностью, превышающей или равной 98%. Наиболее качественными из доступных технологий являются иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунохемилю-минесцентный анализ (ИХЛА). 
Одним из недостатков серологического анализа является ограниченная чувствительность на ранней стадии. В случае SARS-CoV-2 исследования показали, что выработка IgM и IgG начинается практически одновременно в первую неделюот заражения, и обычно обнаруживается со второй недели (см. рис 1).Интересно, что появление IgM происходит одновременно с IgG, но IgM диагностируется короткий срок, а это значит, что по IgM – мы можем только оценивать сроки заражения.  
В выборе используемых тест-систем для серологии надо прежде всего учитывать используемые мишени-антигены, которые определяют чувствительность и специфичность серологических анализов. К примеру, по иммуноглобулину G (IgG), мишень - белок S, продуцируемый на более поздней стадии инфекции SARS-CoV-2показал более низкий уровень чувствительности и большую специфичность (особенно субъединица S1), чем белок N, который продуцируется и может быть диагностирован даже раньше чем IgMили анти-S-белок-IgG. При этом антитела к белку Nи снижаются раньше, чем к S, а значит если использовать тест-системы учитывающих только один белок (Nили S) может получить низкую достоверность в оценке статуса вирусных процессов. 
Рекомендация:систематическое использование серологических тест-систем к S и N белкам: S - для сероэпидемиологических исследований, так как титр S-белка лучше отражают защиту от повторного заражения, а N – позволит дополнительно, в ранние сроки определить вирусологический статус Ковид 19, и, в частности, при ПЦР-отрицательных результатах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Таким образом, в текущих реалиях состояния лабораторной диагностики SARS-CoV-2 в Узбекистане необходимо разделять предметную значимость каждого метода, а именно: а) какова роль результата ПЦР и/или на антитела в оценке и противодействию эпидемии, б) в чем их значимость для конкретного пациента, выбора тактики лечения. Во втором случае, значимость ПЦР-результата преувеличена, а роль серологических тестов недооценена для противодействия эпидемии и в клинической практике.
Как описано выше, ПЦР-анализ может быть ложноотрицательным или положительным по многим причинам. Cерологические анализы помогут не только оценить эпидемиологическиесвязи, и разобраться в случаях когда результаты ПЦР отрицательные, но и расширить спектр тестируемой популяции, особенно среди бессимптомных и лиц с легкой клиникой. 
В целом, серология позволит:
•Прояснить расхождения между клинической картиной и результатами ПЦР
•Сероэпидемиологические исследования - оценить масштабы продолжающейся вспышки и степень ее распространения 
•Выявление лиц с очень высокими титрами антител, которые могут быть применены для донорства крови, получения иммуноглобулинов для пассивной иммунотерапии 
•Ретроспективный диагноз инфекции SARS-CoV-2

Предлагаем следующее использование молекулярных и серологических методов в комбинации для клинической интерпретации:
 

Татьяна Хегай, Институт иммунологии и геномики человека АН РУз. 19.07.2020